外顯子組測序是指利用高效的序列捕獲技術將基因組中的外顯子區(qū)域捕獲后進行高通量測序的方法。在人類基因中大約有180,000個外顯子，雖然外顯子組僅占人類基因組的1%（約30MB），但是約85%的致病突變發(fā)生在外顯子組區(qū)域。外顯子組測序主要用于識別和研究與疾病、種群進化相關的編碼區(qū)及UTR區(qū)域內(nèi)的結(jié)構(gòu)變異。結(jié)合大量的公共數(shù)據(jù)庫提供的外顯子數(shù)據(jù)，能夠更好地解釋所得變異結(jié)構(gòu)之間的關聯(lián)和致病機理。相比傳統(tǒng)方法，外顯子組測序能夠更經(jīng)濟高效的檢測外顯子區(qū)域的變異情況，以此來為臨床診斷和個體化用藥服務。外顯子組測序目前已被廣泛的應用于各種癌癥、單基因病、復雜疾病和罕見遺傳病等研究中。
1、實驗方案
捕獲平臺：Agilent SureSelect Human All Exon V6（最新捕獲試劑盒）
測序策略：Illumina NextSeq 500或HiSeq 3000 PE150
數(shù)據(jù)量：推薦100×以上的深度測序，約10G clean data
2、技術優(yōu)勢
（1）高覆蓋度：同等費用下獲得更高深度測序，SNP檢出率99%；
（2）更高通量：適合大樣本量的研究；
（3）經(jīng)濟高效：相比于全基因組重測序，更加經(jīng)濟、高效；
（4）周期短：加快文章發(fā)表與加速臨床應用。
3、數(shù)據(jù)分析
3.1 標準信息分析
（1）按標準流程進行數(shù)據(jù)整理及數(shù)據(jù)質(zhì)量評估；
（2）與參考序列進行比對、統(tǒng)計測序深度及覆蓋度；
（3）SNP和InDel變異信息檢測；
（4）SNP和InDel變異所在基因的功能注釋（GO、Pathway）；
（5）CNV檢測和注釋分析；
（6）變異基因保守性預測及致病性分析（SIFT、Polyphen-2、GERP）；
3.2 高級信息分析
（1）癌基因/抑癌基因/易感基因篩查；
（2）高頻突變基因統(tǒng)計及通路富集分析；
（3）NMF突變特征及突變頻率分析；
（4）已知驅(qū)動基因篩選；
（5）基因組變異Circos圖展示。
4、捕獲平臺介紹
Agilent SureSelect Human All Exon V5 特點如下：
（1） 捕獲范圍為50Mb，包括21,522條基因的357,999個外顯子區(qū)域；
（2） 根據(jù)CCDS、RefSeq、GENECODE、miRNABase、TCGA及UCSC數(shù)據(jù)庫設計探針，可有效獲得外顯子區(qū)及其周邊區(qū)域的變異信息。
（3）周期短，僅需1.5天，測序樣品便可準備就緒。
5、技術流程
6、案例分析
案例（1）外顯子組測序揭示結(jié)直腸癌耐藥新機制
該研究通過對129個結(jié)直腸癌小鼠進行外顯子測序以及拷貝數(shù)變異分析，對55個人類腫瘤樣本進行目標區(qū)域測序，鑒別出了晚期大腸癌中與耐藥和藥物敏感性相關的6個基因的新突變， ERBB2，EGFR，F(xiàn)GFR1，PDGFRA，MAP2K1和IRS2，并揭示出了對西妥昔單治療抗產(chǎn)生耐藥的新機制。這項研究證實替身可為在人類癌癥中評估靶向療法及將這些反應與潛在基因組學關聯(lián)起來提供一種系統(tǒng)的途徑。在替身中取得成功的療法或許可以指導個體患者的新療法及幫助藥物開發(fā)。
圖1 不同體細胞突變對西妥昔單抗治療腫瘤的增長的影響
案例（2）遺傳及化學誘導的KRAS驅(qū)動的肺癌基因突變?nèi)皥D
對非小細胞肺癌模型的小鼠進行外顯子測序。KrasLA2誘發(fā)的肺癌比致癌物質(zhì)誘發(fā)的肺癌有顯著水平的非整倍體以及拷貝數(shù)變異（CNV），這表明化學物質(zhì)誘導的腫瘤與轉(zhuǎn)基因模型擁有不一樣的腫瘤發(fā)生發(fā)展進程。
圖1遺傳和化學誘導肺癌樣本的拷貝數(shù)情況
圖2 發(fā)生在致癌物誘導腫瘤中的驅(qū)動SNV
案例（3）外顯子組測序發(fā)現(xiàn)皮膚基底細胞癌的新的驅(qū)動基因和發(fā)展路經(jīng)
皮膚基底細胞癌（BCC）是最常見的一種癌癥，90%的人都存在發(fā)病風險，尤其是年齡大和紫外線照射多的人。研究人員測序了236名患者的293個皮膚基底細胞癌（BCC）的腫瘤樣本，并將測序結(jié)果與患者健康細胞的遺傳學圖譜進行比較，發(fā)現(xiàn)了MYCN、PTPN14和LATS1都是BCC的驅(qū)動基因。進一步研究表明，這些癌癥驅(qū)動子也存在于Gorlin綜合征中，這可能就是Gorlin綜合征患者更容易患BCC的原因。
圖1 BCC的突變?nèi)皥D
參考文獻
[1] Bertotti et al. The genomic landscape of response to EGFR blockade in colorectal cancer. Nature, 2015.
[2] Westcott et al. The mutational landscapes of genetic and chemical models of Kras-driven lung cancer. Nature, 2015.
[3] Bonilla et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nat Genet, 2016.
