RNA Immunoprecipitation (RIP) 是研究細胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程的有力工具，能更有效地發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點。RIP-seq技術(shù)使用特異性抗體對RNA結(jié)合蛋白或者特殊修飾的RNA進行免疫共沉淀后，分離純化RNA，通過高通量測序和分析，深度解析與目標(biāo)蛋白相互結(jié)合的RNA的區(qū)域或種類。
應(yīng)用方向
(1)驗證RNA與靶蛋白的相互作用
(2)在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)鑒定RNA與RBP的相互作用網(wǎng)絡(luò)
(3)分析RBP與miRNA、lncRNA等非編碼RNA的相互作用
技術(shù)優(yōu)勢
（1）全轉(zhuǎn)錄組覆蓋：與RIP芯片相比，可在全轉(zhuǎn)錄組范圍對蛋白結(jié)合位點進行篩選與鑒定；
（2）高靈敏度：每個樣本可獲得數(shù)百萬條的序列標(biāo)簽，可發(fā)現(xiàn)研究轉(zhuǎn)錄組上稀有的蛋白結(jié)合位點；
（3）高精確率：可獲得高水平的信噪比數(shù)據(jù)，準(zhǔn)確區(qū)分真實事件與噪音，精確定位蛋白結(jié)合位點；
（4）重復(fù)性好：深度測序保證了檢測隨機性，可不需技術(shù)重復(fù)。
生信分析流程
標(biāo)準(zhǔn)信息分析
（1）將reads比對到基因組：將預(yù)處理reads與reference genome進行mapping，最后得到mapping的sam結(jié)果文件，給出mapping結(jié)果統(tǒng)計；
（2）peak detect：應(yīng)用sam文件進行peak富集區(qū)查找；
（3）motif detect：查找結(jié)合位點區(qū)結(jié)構(gòu)特性，尋找轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域的motif結(jié)構(gòu)；
（4）基因關(guān)聯(lián)：應(yīng)用結(jié)合位點區(qū)位置，確定其周圍所涉及的基因；
（5）關(guān)聯(lián)基因GO差異分析：以參考基因組為背景集對結(jié)合位點關(guān)聯(lián)基因進行GO富集分析。
技術(shù)流程
樣本要求
RIP捕獲的RNA>500ng，濃度>30ng/μL，OD260/280為1.8-2.0，OD260/230為1.5-1.8。
項目周期
標(biāo)準(zhǔn)流程完成時間為50個工作日。
案例分析
案例（1）Rocaglates把DEAD-box蛋白eIF4A運輸?shù)叫蛄羞x擇性翻譯抑制物
Rocaglamide A（RocA）代表一類能夠選擇性殺傷非整倍體腫瘤細胞和抑制特殊mRNA翻譯的蛋白合成抑制劑。RocA作用于真核起始因子4A(eIF4A)，一種ATP依賴性的DEAD-box RNA解旋酶；它的mRNA選擇性是作用于高度結(jié)構(gòu)化的5’非翻譯區(qū)，這一過程高度依賴于eIF4A-調(diào)節(jié)的解旋反應(yīng)。然而，美國加州大學(xué)分子與細胞生物學(xué)系研究人員利用Rip-seq技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)：Rocaglate（藥物）治療也許并不能從表現(xiàn)形式上復(fù)制eIF4A活性的缺失導(dǎo)致的缺陷，因為這藥物實際上只是增加了eIF4A和RNA的親和力。特別說明的是5’非翻譯區(qū)的二級結(jié)構(gòu)對于RocA選擇性而言只是一個次要的決定因素，同時該RocA不會通過降低eIF4A有效性來抑制翻譯。相反，在體外和細胞中，RocA以ATP非依賴性的方式特異性地將eIF4A夾送到polypurine序列中。本研究通過這個重要的抗癌化合物來闡明了選擇性翻譯抑制的重要機理。
圖1 由RocA選擇性翻譯抑制導(dǎo)致的作用于eIF4A的RNA序列選擇性改變
參考文獻
[1] Iwasaki et al. Rocaglates convert DEAD-box protein eIF4A into a sequence-selective translational repressor. Nature, 2016.
