環(huán)狀RNA（circular RNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類特殊的非編碼RNA，它大量存在于真核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，是mRNA在剪接的過程中，上游exon的5’端與下游exon的3’端剪接到一起，從而形成的首尾相接的環(huán)狀分子。
研究發(fā)現(xiàn)，高等動(dòng)物中circRNA的種類和含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過預(yù)期。circRNA具有很多重要的調(diào)控功能，如circRNA可以作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）結(jié)合胞內(nèi)miRNA，阻斷miRNA對(duì)其靶基因的抑制作用。除此以外，circRNA也具有調(diào)控其他類型RNA、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性等功能。circRNA在不同物種中具有保守性和組織表達(dá)特異性，且circRNA對(duì)RNase不敏感，因此它比線性RNA更為穩(wěn)定，所以circRNA在疾病新型診斷與治療方法研發(fā)方面有巨大潛力和重要意義。
實(shí)驗(yàn)方案
測(cè)序平臺(tái)和方式：Illumina 平臺(tái) PE150
數(shù)據(jù)量：12G clean data/樣
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
（1）多物種選擇：可直接對(duì)人、大鼠和小鼠樣本進(jìn)行最全面的circRNA分析，亦可發(fā)現(xiàn)新的circRNA（其他物種需特殊評(píng)估）；
（2）高精確度：數(shù)字化信號(hào)，可預(yù)測(cè)到基因家族中相似基因以及不同可變剪切類型產(chǎn)生的circRNA序列信息；
（3）高覆蓋度：新一代高通量測(cè)序技術(shù)的高深度覆蓋，可以檢測(cè)到低豐度的稀有circRNA。
數(shù)據(jù)分析
（1）測(cè)序質(zhì)量評(píng)估：
原始數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計(jì)
Clean數(shù)據(jù)堿基組成和質(zhì)量分布圖
（2）比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)：
比對(duì)數(shù)據(jù)Reads數(shù)分布統(tǒng)計(jì)
（3）circRNA鑒定：
circRNA統(tǒng)計(jì)列表
circRNA的長(zhǎng)度分布
circRNA的來源分布
已知circRNA的注釋
（4）circRNA的表達(dá)水平及差異表達(dá)分析：
circRNA的表達(dá)水平分析
circRNA的差異表達(dá)結(jié)果
兩兩樣本之間的差異表達(dá)
樣本間共享和特有circRNA統(tǒng)計(jì)分析
（5）circRNA的來源基因分析：
circRNA來源基因的GO富集分析
circRNA來源基因的KEGG富集分析
（6）circRNA與miRNA的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析
技術(shù)流程
案例分析
案例（1）環(huán)狀RNA促進(jìn)結(jié)腸癌增殖和轉(zhuǎn)移
研究者對(duì)正常組織和腫瘤結(jié)腸組織樣本進(jìn)行了circRNA測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量在腫瘤細(xì)胞中特異性升高的circRNA，其中一些circRNA得到了RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證。研究人員對(duì)其中一類新的circRNA——circCCDC66的功能進(jìn)行了深入研究。結(jié)果表明circCCDC66在息肉和結(jié)腸癌中表達(dá)水平升高，并且與不良預(yù)后相關(guān)。通過在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中進(jìn)行功能獲得性研究和功能缺失性研究，研究人員證明circCCDC66能夠控制多個(gè)生理過程，包括細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和非貼附性生長(zhǎng)等。進(jìn)一步的研究表明circCCDC66通過調(diào)節(jié)一系列癌基因來發(fā)揮它的功能，并且在異種移植腫瘤模型和原位模型中敲低circCCDC66的表達(dá)均能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)和侵襲。
以上發(fā)現(xiàn)表明，環(huán)狀RNA在癌癥發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮癌基因功能。該研究為了解環(huán)狀RNA與癌癥之間的關(guān)系以及尋找新的癌癥治療手段提供了重要參考信息。
圖1 circCCDC66促進(jìn)結(jié)腸癌增殖
案例（2）circHIPK3通過結(jié)合miRNA來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)
對(duì)6個(gè)正常組織和7個(gè)腫瘤組織測(cè)序，共鑒定出27296個(gè)circRNA分子，超過80%的環(huán)狀RNA分子起源于外顯子（exon）區(qū)。這些circRNA在正常組織和腫瘤組織中存在表達(dá)差異。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)來源于2號(hào)外顯子HIPK3的circHIPK3，它存在18個(gè)結(jié)合位點(diǎn)能夠與9個(gè)miRNA結(jié)合，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。
圖1 不同組織circRNA的表達(dá)差異
圖2 七個(gè)癌組織和對(duì)應(yīng)正常組織中鑒定的特異性circRNA的數(shù)目
圖3 circRNA表達(dá)豐度多維圖
參考文獻(xiàn)
[1] Hsiao et al. Noncoding Effects of Circular RNA CCDC66 Promote Colon Cancer Growth and Metastasis. Cancer Research, 2016.
[2] Zheng et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications, 2016.
